多年來，垂直擴(kuò)散池，又稱為Franz擴(kuò)散池，一直被用于研究藥物分子的皮膚傳導(dǎo)。這種簡(jiǎn)單的體外方法對(duì)于測(cè)量藥物經(jīng)皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)和/或滲透到皮膚中的速率和程度非常有用。如果應(yīng)用了相關(guān)的皮膚模型，則它是評(píng)估經(jīng)皮藥物吸收的有用工具，特別是當(dāng)目的是評(píng)估新藥候選物或篩選用于皮膚應(yīng)用的新藥模擬物時(shí)。在過去的幾十年里，垂直擴(kuò)散池的使用也成為局部和透皮藥物產(chǎn)品性能測(cè)試的重點(diǎn)。然而，當(dāng)體外試驗(yàn)旨在評(píng)估局部或透皮產(chǎn)品在生產(chǎn)后、保質(zhì)期內(nèi)或放大和批準(zhǔn)后變化后的質(zhì)量(SUPAC，下載鏈接見本文末尾部分)時(shí)，基于皮膚的擴(kuò)散模型不再適用。使用人皮膚或動(dòng)物皮膚的試驗(yàn)方法當(dāng)然需要了解各種藥劑在目標(biāo)物種皮膚上的過程、途徑和驅(qū)動(dòng)力，但由于皮膚特性的種內(nèi)和種間可變性較大，不適用于產(chǎn)生對(duì)質(zhì)量控制(QC)至關(guān)重要的可再現(xiàn)和穩(wěn)健的試驗(yàn)條件。因此，出于QC目的，IVRT的目標(biāo)是關(guān)注物理屬性(溶解度、微觀粘度、乳液狀態(tài)、粒度等)可能影響藥物從半固體制劑中釋放行為，則皮膚必須用適當(dāng)?shù)哪ご妗?/span>同時(shí)在IVRT實(shí)驗(yàn)中，必須明確定義與藥物釋放相關(guān)的所有檢測(cè)參數(shù)，以獲得一種有區(qū)分力且耐用性良好的QC檢測(cè)方法。

本研究目的是參考Sandra Klein及銳拓實(shí)驗(yàn)室的研究成果，展示不同實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)垂直擴(kuò)散池中獲得體外藥物釋放曲線（IVRT曲線）的影響，也同時(shí)展示IVRT方法開發(fā)過程中，實(shí)驗(yàn)室方法開發(fā)人員需要考慮的部分內(nèi)容，以減少IVRT方法開發(fā)中的存在的問題。

2.1膜材料和孔徑的影響

采用組成和稠度不同的兩種凝膠制劑Voltaren® Emulgel®和Diclofenac-ratiopharm Gel，探索了膜材料和孔徑對(duì)體外擴(kuò)散速率的影響。溶出介質(zhì)為pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，攪拌速度為800 rpm。根據(jù)FDA 《In Vitro Release Test Studies for Topical Drug Products Submitted in ANDAs Guidance for Industry》，釋放速率為累積釋放量對(duì)時(shí)間平方根的回歸曲線的斜率r。結(jié)果如圖1所示。

溶出曲線表明，膜材料和孔徑均可對(duì)雙氯芬酸凝膠制劑的體外擴(kuò)散速率產(chǎn)生影響。盡管所測(cè)試的大多數(shù)膜的結(jié)果沒有很大差異，但當(dāng)使用PET膜時(shí)，兩種配方的擴(kuò)散速率都要高得多。然而，這很可能是使用這種膜引起的偏差。由于很難將PET膜固定到位，且PET膜易起皺，因此未將其用于后續(xù)研究。總體而言，聚砜(Tuffryn)膜被視為最合適的膜，用于后續(xù)篩選實(shí)驗(yàn)。

2.2溶出介質(zhì)pH的影響

雙氯芬酸是一種弱酸，其鈉鹽的pKa值為4.0(25°C)。根據(jù)藥物的酸堿性，預(yù)計(jì)受體介質(zhì)的pH值會(huì)影響擴(kuò)散速率。為了考察溶出介質(zhì)pH的影響,使用pH為7.4、6.5和5.0的三種不同pH的溶出介質(zhì)，考察了溶出介質(zhì)pH對(duì)Voltaren® Emulgel® 和 Diclac® Schmerzgel的擴(kuò)散速率、藥物釋放的影響。使用Tuffryn膜分離制劑和溶出介質(zhì)，用磁棒和螺旋攪拌器以800 rpm攪拌溶出介質(zhì)。結(jié)果見圖2。

正如預(yù)期，在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，兩種配方的藥物釋放速率最高。溶出介質(zhì)越接近藥物pKa值，藥物釋放速率減慢，這在Diclac® Schmerzgel的釋放曲線中尤其明顯。在pH 5.0緩沖液中，藥物濃度達(dá)到了一個(gè)平穩(wěn)值，這反映了雙氯芬酸在該pH值下的溶解性差，也表明當(dāng)實(shí)驗(yàn)旨在考察漏槽條件下的藥物釋放時(shí)，該緩沖液不合適。為了達(dá)到漏槽條件，受體介質(zhì)必須具有高溶解或帶走藥物的能力，并且受體介質(zhì)中的藥物濃度不應(yīng)超過釋放基質(zhì)中藥物溶解度的10%(<1724> SEMISOLID DRUG PRODUCTS—PERFORMANCE TESTS)。由于新候選藥物的漏槽條件很難確定，因此在開始釋放實(shí)驗(yàn)之前，應(yīng)測(cè)定化合物在推薦溶出介質(zhì)中的溶解度，以確保選擇正確的溶出介質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于雙氯芬酸等酸性藥物，當(dāng)目的是觀察不受pH影響下的解離(可通過Hendersson-Hasselbalch方程計(jì)算)和藥物化合物溶解度阻礙的擴(kuò)散時(shí)，溶出介質(zhì)應(yīng)為pKa 加至少2個(gè)pH單位。

2.3脫氣的影響

我們進(jìn)行了多次對(duì)接受介質(zhì)使用前脫氣和不脫氣對(duì)照實(shí)驗(yàn)。每當(dāng)介質(zhì)未脫氣且氣泡出現(xiàn)在膜下時(shí)，這將導(dǎo)致溶出速率大大降低(取決于氣泡的數(shù)量和大小)。然而，繪制藥物釋放量(μg)與的關(guān)系圖仍可得出線性關(guān)系，這也是USP1724進(jìn)行IVRT分析時(shí)要求使用Higuchi模型分析數(shù)據(jù)的原因。而使用脫氣機(jī)可以用于介質(zhì)的脫氣并有效地改善氣泡問題。

2.4攪拌速度和攪拌器類型的影響

使用Voltaren Emulgel作為試驗(yàn)配方，研究了不同攪拌速度和不同攪拌器類型(即帶有和不帶有附加螺旋攪拌器的磁性攪拌棒)的影響(見圖6)。結(jié)果清楚地表明，攪拌速度和攪拌器類型對(duì)釋放/擴(kuò)散速率都有影響(圖3)。

圖3左所示的結(jié)果表明，在擴(kuò)散池底部使用簡(jiǎn)單的磁性攪拌棒（下圖）并不是最佳攪拌器模式，尤其是在低攪拌速度下，流通池中的流體力學(xué)不足以進(jìn)行充分混合。圖3中所示的曲線還表明，對(duì)于每種攪拌器類型，都存在臨界攪拌速度。使用磁性攪拌棒進(jìn)行充分混合需要非常高的攪拌速度(> 800 rpm)。使用磁性攪拌棒和螺旋攪拌器，在200 rpm的攪拌速度下，可以觀察到低藥物釋放率和高的標(biāo)準(zhǔn)偏差。然而，隨著攪拌速度提高，釋放速率重現(xiàn)性顯著改善，在等于或高于600 rpm的攪拌速度下，這些曲線可以重合。因此，600以上的攪拌速率是提高釋放速率重現(xiàn)性的優(yōu)選速率。

另外，銳拓實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步對(duì)攪拌子的結(jié)構(gòu)研究后發(fā)現(xiàn)，良好的攪拌子結(jié)構(gòu)（下圖）有助于充分混合擴(kuò)散池中的藥液。以KHP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為樣品，KHP的吸光度在取樣臂&接受池中的數(shù)值為表征，研究了不同轉(zhuǎn)速條件下攪拌取樣臂與接受池中樣品的混合效果，研究中發(fā)現(xiàn)，在不施加攪拌的條件下靜置30sec，取樣臂中的藥物無法通過自由擴(kuò)散達(dá)到混合均勻的效果，取樣臂中的藥物濃度僅為接受池中藥物濃度的1/60。但是在分別施加200rpm及600rpm的攪拌條件下，取樣臂中的藥品濃度與接受池主體中的藥品濃度能夠在30sec內(nèi)迅速達(dá)到均勻，從而解決了取樣臂中藥物濃度與主體藥物濃度不一致的問題，進(jìn)一步有效地避免FDA 1724章節(jié)中描述的負(fù)通量的產(chǎn)生。

2.5最佳條件下市售半固體雙氯芬酸制劑的藥物釋放

基于第一組實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果，認(rèn)為以下測(cè)試參數(shù)適用于從用于皮膚用的半固體雙氯芬酸制劑中獲得可靠且可再現(xiàn)的體外釋放曲線:32°C、磷酸鹽緩沖液pH 7.4、孔徑為0.45 m的聚砜膜和以800 rpm的攪拌速率。按照USP1724的要求，使用這些設(shè)置進(jìn)行的釋放實(shí)驗(yàn)應(yīng)能夠檢測(cè)成品藥物釋放特性的變化。將這些測(cè)試參數(shù)應(yīng)用于:

a)新鮮制備的雙氯芬酸鈉水溶液(pH 7.4)，

b)市售的雙氯芬酸凝膠

c)市售雙氯芬酸藥膏藥

探究是否可以確定不同的藥物釋放特征。由此產(chǎn)生的釋放曲線如圖4-5所示。

圖4為雙氯芬酸鈉溶液和凝膠的溶出曲線。可以清楚地看到雙氯芬酸鈉溶液能夠迅速?gòu)哪ね高^，所以膜對(duì)藥物從液體制劑中的擴(kuò)散沒有影響，這表明選擇該膜是正確的。同時(shí)注意到，溶液中的雙氯芬酸鈉擴(kuò)散到受體介質(zhì)中至少需要30分鐘，因此＜30分鐘的取樣點(diǎn)在局部藥物的研究中無分析意義。而在各種凝膠配方中，Diclofenac- ratiopharm gel的藥物釋放速率最高。這與凝膠的稠度非常一致，Diclofenac- ratiopharm gel稠度顯著低于所測(cè)試的所有其他配方因此其擴(kuò)散速率也顯著高于其他配方而低于溶液配方。

其余配方表現(xiàn)出相似的釋放曲線。Voltaren Emulgel和Voltaren Schmerzgel的釋放曲線甚至可重合，對(duì)arthrex Schmerzgel、Diclac Schmerzgel和Sandoz Schmerzgel的數(shù)據(jù)也進(jìn)行了同樣的比較。仔細(xì)比較這些配方的組成后，這一結(jié)果并不令人驚訝，因?yàn)閮煞NVoltaren產(chǎn)品的非活性成分沒有差異，arthrex Schmerzgel和Sandoz Schmerzgel的非活性成分也是如此。后兩種配方的溶出曲線與Diclac Schmerzgel的相似性無法用產(chǎn)品的組成來解釋，但由于產(chǎn)品注冊(cè)用于相同適應(yīng)癥，因此很可能它們被設(shè)計(jì)為生物等效物，這可能會(huì)反映在使用Franz擴(kuò)散池所獲得的體外釋放曲線中。

圖5是乳膏的釋放曲線。顯而易見的是，三種雙氯芬酸乳膏配方中的兩種(Flector Schmerzpflaster和Voltaren Wirkstoffpflaster)也顯示出重合的釋放曲線。然而，基于包裝說明書中給出的信息，這兩種制劑由相同的雙氯芬酸鹽和相同非活性成分組成，因此最有可能的是，這些制劑完全相同，因此也表現(xiàn)出相同的釋放行為。相比之下，Diclofenac-ratiopharm® Schmerzpflaster藥物溶出具有溶出速率大大降低的特征，這與該制劑的組成(不同的雙氯芬酸鹽和不同的非活性成分)相符。

總之，在乳膏釋放實(shí)驗(yàn)中獲得的釋放曲線表明，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，乳膏基質(zhì)控制藥物釋放。

將雙氯芬酸凝膠的釋放曲線與雙氯芬酸乳膏的釋放曲線進(jìn)行比較，顯然，這兩種制劑表現(xiàn)出不同的釋放動(dòng)力學(xué)。雙氯芬酸凝膠中獲得的大多數(shù)釋放曲線可以通過繪制藥物釋放量對(duì)得出線性關(guān)系，表明瞬時(shí)釋放速率與1 / √t成比例。對(duì)于溶液、懸浮液或乳液類型的半固體制劑系統(tǒng)，這種釋放行為是典型的。相比之下，從乳膏的釋放曲線中可以觀察到幾乎零級(jí)的藥物釋放，其中釋放速率由乳膏基質(zhì)控制的。

綜上所述，用最優(yōu)條件的IVRT測(cè)試參數(shù)獲得的結(jié)果表明了，IVRT是一種可靠且具有有鑒別能力的體外研究方法，該方法適用于測(cè)定用于皮膚用的半固體雙氯芬酸制劑的不同藥物釋放機(jī)制和釋放性質(zhì)。

雖然本研究中的系列實(shí)驗(yàn)側(cè)重于基本方面，但對(duì)于闡明開發(fā)用于皮膚應(yīng)用的半固體劑型的體外釋放試驗(yàn)方法過程中的典型陷阱非常有用。使用不同測(cè)試參數(shù)設(shè)置獲得的結(jié)果表明，選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)試方法對(duì)于藥物釋放實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。因此，本研究的結(jié)果可能對(duì)準(zhǔn)備開發(fā)或正在開發(fā)半固體制劑的體外釋放方法非常有幫助。

然而，由于藥物性質(zhì)和儀器細(xì)節(jié)都可能對(duì)體外藥物釋放研究的結(jié)果產(chǎn)生巨大影響，因此為本研究確定的最佳試驗(yàn)參數(shù)不應(yīng)簡(jiǎn)單地適用于其他實(shí)驗(yàn)，具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù)取決于垂直擴(kuò)散池的尺寸和藥物性質(zhì)。如本文所述，應(yīng)根據(jù)具體案例建立和驗(yàn)證最佳試驗(yàn)參數(shù)/條件。最后但同樣重要的是，在發(fā)布擴(kuò)散池實(shí)驗(yàn)的設(shè)置和結(jié)果時(shí)，報(bào)告所有相關(guān)的測(cè)試參數(shù)對(duì)確保所報(bào)告的測(cè)試結(jié)果的有效性至關(guān)重要。

參考文獻(xiàn)：Influence of different test parameters on in vitro drug release from topical diclofenac formulations in a vertical diffusion cell setup

Guidance for Industry Nonsterile Semisolid Dosage Forms Scale-Up and Postapproval Changes Chemistry, Manufacturing, and Controls; In Vitro Release Testing and In Vivo Bioequivalence d0cumentation.pdf